Περίληψη
Στις αποικίες μελισσών (Apis mellifera), βασίλισσες και εργάτριες είναι πανομοιότυπες (εναλλακτικές) μορφές των θηλυκών ενήλικων μελισσών που αναπτύσσονται από γενετικά πανομοιότυπους (ίδιους) ζυγωτές (απογόνους) αλλά η διαφοροποίηση Βασίλισσας εργάτριας ,γίνεται λόγω της διαφορετικής τροφής.
Βασίλισσες και εργάτριες έχουν εμφανείς διαφορές στην μορφολογία, ανατομία και την συμπεριφορά τους , γνωστό ως διαφοροποίηση κάστας.
Παρά ορισμένες βασικές ιδέες που υπάρχουν, ο ακριβής μηχανισμός (διαδικασία) που ευθύνεται για το φαινόμενο αυτό, ιδιαίτερα σε μοριακό επίπεδο, παραμένει ασαφής, αν και έχει επιτευχθεί, κάποια πρόοδος.
Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τα επίπεδα mRNA του TOR (στόχος της ραπαμυκίνης) και Dnmt3 (DNA μεθυλοτρανσφεράση 3) στενά συνδεδεμένα στη διαφοροποίηση βασίλισσας- εργάτριας (καστών) στις μέλισσες.
Ερευνήσαμε επίσης τον μηχανισμό, ανάπτυξης στη βασίλισσα και στις εργάτριες από το στάδιο των προνυμφών πρώτης (1) ημέρας και τρίτης (3) ημέρας [ την έκφραση του mRNA του S6K (παρόμοια με κινάση rpS6-P70-πρωτεΐνη γονίδιο που συνδέεται στενά με την οργανική ανάπτυξη].
Τέλος, διερευνήθηκε η κατάσταση μεθυλίωσης ( απεικόνιση γονιδίων στα κύτταρα [κελιά] ) αυτών των τριών γονιδίων σε αντίστοιχες προνύμφες.
Εμείς δεν βρήκαμε καμία διαφορά στην έκφραση του mRNA ( σύνθεση πρωτεινών ) των τριών γονιδίων, μεταξύ Βασίλισσας και εργατριών στις προνύμφες του 1ου σταδίου (δηλαδή από την πρώτη μέχρι την τρίτη ημέρα)!
Ωστόσο, μετά την 3 ημέρα προνύμφες βασίλισσας είχαν υψηλότερο επίπεδο των TOR mRNA από τις προνύμφες των εργαζομένων. επίπεδα μεθυλίωσης και των τριών γονιδίων ήταν χαμηλότερα σε προνύμφες βασίλισσας από τις προνύμφες των εργαζομένων, αλλά οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές.
Αυτά τα ευρήματα μας δίνουν τα βασικά στοιχεία για ευρύτερη και καλύτερη κατανόησή στις διαφορές των προνυμφών στις βασίλισσες και εργάτριες μέλισσες.
Η μέλισσα (Apis mellifera) είναι ένα από τα πιο κοινωνικά προηγμένα και μέχρι σήμερα καλύτερα μελετημένο είδος στο Hymenopterans (Amdam et al, 2004? Omholt & Amdam, 2004).
Μια αποικία μελισσών συνήθως αποτελείται από μία μόνο βασίλισσα, κανένα μέχρι μερικές χιλιάδες κηφήνες, ανάλογα με τις αναπαραγωγικές απαιτήσεις, και 20-40000 εργάτριες (Winston, 1987).
Βασίλισσες και εργάτριες, αναπτύσσονται από γενετικά πανομοιότυπα (ίδια) γονιμοποιημένα ωάρια, ωστόσο οι βασίλισσες είναι διπλάσιες σε μέγεθος από τις εργάτριες, έχουν πολύ μεγαλύτερη διάρκεια ζωής και έχουν εξειδικευμένη ανατομία ενώ αναπτύσσονται ταχύτερα από το αυγό στο ενήλικο.
Οι Βασίλισσες είναι γόνιμες, αλλά οι εργάτριες είναι στειρωμένες.
Οι εργάτριες εκτελούν διάφορες εργασίες που αλλάζουν ανάλογα την ηλικία τους, όπως η κατασκευή κηρήθρας, καθαρισμός, παραμάνες, της επεξεργασίας στο νέκταρ, αναζήτησης τροφής και τη φύλαξη, ενώ μοναδικό καθήκον των βασιλισσών είναι τα αυγά για την αναπαραγωγή των αποικιών τους (Camazine, 1991? Χούβερ et al, 2005? Kucharski et al, 2008? Page & Peng, 2001? Rueppell κ.ά., 2005, 2007).
Διαφοροποίηση των καστών στην κοινωνικά έντομα έχει μελετηθεί κατά τη διάρκεια αρκετών δεκαετιών και η μέλισσα έχει χρησιμοποιηθεί ως ένα μοντέλο πρότυπου ζώου από το δέκατο όγδοο αιώνα (Corona et al, 1999? Cristino et al, 2006? Page & Peng, 2001? Patel et al, 2007? Rembold et al, 1974? Wheeler et al, 2006).
Κατά συνέπεια, η σχέση μεταξύ διατροφής και ανάπτυξης έχει αναγνωριστεί εδώ και περισσότερα από 100 χρόνια (Corona κ.ά., 1999? Patel et al, 2007).
Είναι σαφές ότι οι προνύμφες που προορίζονται για βασίλισσες τρέφονται με βασιλικό πολτό, ενώ οι άλλες προνύμφες ( θηλυκές ) τρέφονται με μείγμα τροφής για εργάτριες.
Ο βασιλικός πολτός περιέχει περίπου 12% ζάχαρη (υγρή μάζα), ενώ των εργατριών έχει μόνο 4% ζάχαρη (Corona κ.ά., 1999? Ishay et al, 1976).
Επιπλέον, το είδος ( τροφής ) και η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες είναι διαφορετικές μεταξύ βασιλισσών και των εργατριών.
Σε μια πρόσφατη μελέτη, Kamakura (2011) έδειξε ότι royalactin πρωτεΐνη 57-kDa είναι η υπεύθυνη, για την αύξηση του μεγέθους του σώματος των Βασιλισσών, καθώς και για την ανάπτυξη των ωοθηκών, όπως και για τον λιγότερο χρόνο εκκόλαψης ( 16 ημέρες ).
Ωστόσο, αν και άλλοι μηχανισμοί ρυθμίζουν την κάστα διαφοροποίησης παραμένει άγνωστη.
Πολλές πτυχές της ζωής των μελισσών έχουν ανακαλυφθεί από τις νέες τεχνολογίες μοριακής βιολογίας και την ολοκλήρωση της όλης αλληλουχίας του γονιδιώματος της Apis mellifera (Μελισσών Genome Sequencing Consortium, 2006).
Η 3 και 4 ημέρα στην ανάπτυξη των προνυμφών είναι μια κρίσιμη περίοδος της γονιδιακής έκφρασης / ρύθμισης κατά τη διάρκεια Διφαινικός ανάπτυξη των καστών στις λάρβες (Barchuk et al, 2007? Corona et al, 1999? Evans & Wheeler, 1999? Wheeler et al, 2006).
Πρωτεΐνες και θρεπτικά συστατικά και το σύστημα μεταφοράς δυο στοιχείων (ενέργεια-αισθητήρια κινάση) είναι ένας βασικός παράγοντας στις προνύμφες για τον καθορισμό της κάστας ( βασίλισσα – εργάτρια ) της Apis mellifera?
Προνύμφη 3ου σταδίου, βασίλισσας έχει περίπου δύο φορές υψηλότερα επίπεδα TOR mRNA από προνύμφες τρίτου σταδίου εργάτριας (Patel et al, 2007).
Χρησιμοποιώντας ραπαμυκίνη / FΚ506 και παρεμβάλλοντας στο RNA (RNAi) ένα γονίδιο χειραγώγησης μέθοδος, Patel et al (2007) απέδειξαν ότι σε προνύμφες που προορίζονται για βασίλισσες, η ραπαμυκίνη μπορεί να χειραγωγεί ( αναστέλλει) ειδικά τη δραστηριότητα των TOR και γίνεται αιτία, για την ανάπτυξη των χαρακτηριστικών των εργατριών, και ότι το γονίδιο TOR μετατρέπει τις προνύμφες που προοριζόταν για βασίλισσες σε εργάτριες (Patel et al, 2007) .
Άλλη σημαντική ανακάλυψη είναι ότι οι μύγες των φρούτων και τα ποντίκια με ανεπάρκεια S6K, ( πρωτεΐνης που οδηγεί σε μια αύξηση στην πρωτεϊνική σύνθεση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό), εμφανίζουν σοβαρές ανωμαλίες όπως αναπτυξιακή καθυστέρηση και μικρότερα μεγέθη σώματος (Montagne & Steward, 1999? Shima et al, 1998).
Μεθυλοτρανσφεράση Dnmt3 στο DNA, είναι υπεύθυνη για την μεθυλίωση της κυτοσίνης στα CpG δινουκλεοτίδια του γονιδιακού DNA, είναι μια πιθανή βασική κινητήρια δύναμη παγκοσμίως του επιγενετικού επαναπρογραμματισμού σε μέλισσες (Kucharski et al, 2008).
Όταν έγινε θεραπεία με Dnmt3 RNA σε πρόσφατα εκκολαπτόμενες προνύμφες μελισσών, τα περισσότερα άτομα γίνονται βασίλισσες με πλήρως ανεπτυγμένες ωοθήκες (Kucharski et al, 2008). Μετά, Kucharski et al (2008) απέδειξαν ότι η προσθήκη Dnmt3 μπορεί να προκαλέσει αλλαγές στο γονίδιο και αλλάζει στις προνύμφες την αναπτυξιακή τροχιά.
Με βάση αυτά τα ευρήματα, εμείς εικάζουμε ότι τα γονίδια TOR, S6K και Dnmt3 εκφράζονται διαφορικά σε προνύμφες βασίλισσας τρίτου σταδίου και τις προνύμφες των εργατριών και ήταν πρόθυμοι να διαπιστώσουμε εάν οι δραστηριότητες των TOR και S6K ρυθμίζονται μέσω μεθυλίωσης του DNA από Dnmt3.
Χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA μπορεί να προωθήσει την έκφραση mRNA στα σπονδυλωτά (Jones & Gonzalgo, 1997? Razin, 1998? Weiss & Cedar, 1997? Wolffe κ.ά., 1999? Yamada et al, 2008).
Εδώ, μετρήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του TOR, S6K και Dnmt3 και εξετάστηκαν τα επίπεδα μεθυλίωσης CpG για αυτά τα γονίδια σε βασίλισσα και εργάτρια σε προνύμφες τριών (3) ημερών (χρησιμοποιώντας πρότυπα γονιδιακής έκφρασης του 1ου σταδίου νύμφες σαν δείγμα αναφοράς).
Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η σχετική ποσότητα του επιπέδου TOR mRNA σε προνύμφες τρίτου (3) σταδίου βασίλισσας είναι υψηλότερο σε σχέση με τις προνύμφες των εργαζομένων, αλλά δεν υπάρχει καμία διαφορά στα επίπεδα S6K ή Dnmt3 mRNA μεταξύ των βασιλισσών και των εργαζομένων.
Οι ποσότητες Cpg μεθυλίωσης των τριών γονιδίων σε προνύμφες βασίλισσας είναι χαμηλότερα (20%) σε σχέση με τις προνύμφες των εργαζομένων, αλλά οι διαφορές δεν είναι στατιστικά σημαντικές.
ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ
προνύμφες μελισσών
Μελισσών προνύμφες τέθηκαν σε μια δυνατή διώροφη κυψέλη 8 πλαισίων χρησιμοποιώντας μία βασίλισσα.
Η αποικία τροφοδοτήθηκε με σιρόπι 1/1 νερό ζάχαρη σε ποσότητα 500 mL κάθε δεύτερη μέρα.
Η βασίλισσα περιορίστηκε να γεννήσει τα αυγά σε ένα τετράγωνο (20 cm Χ 20 cm) κομμάτι κηρήθρας, χρησιμοποιώντας μεταλλικό πλέγμα.
Με το που έγιναν προνύμφες (4 ημέρα) μεταμοσχεύθηκαν σε βασιλικά κελιά πλαστικά χρησιμοποιώντας βελονάκι εμβολιασμού, και τις υπόλοιπες προνύμφες στην κηρήθρα τις αφήσαμε για να γίνουν εργάτριες.
Τα Βασιλοκέλια προσεκτικά τοποθετήθηκαν στο κέντρο του πάνω πατώματος.
Μετά από 24 και 72 ώρες προνύμφες συλλέχθηκαν για πειράματα (Kucharski et al, 2008).
Ανάλυση του DNA
Εννέα προνύμφες (βασιλισσών ή εργατριών) από την κυψέλη ενώθηκαν μαζί για την ανάλυση του DNA.
Απομόνωση RNA και αντίστροφη μεταγραφή
Ζωντανές νύμφες μεταφέρθηκαν σε σωληνάρια φυγοκέντρου και καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο αμέσως.
Συλλέξαμε προνύμφες από δύο αποικίες μελισσών (Α και Β).
Στην αποικία Α, συνολικά 48 1ου σταδίου νύμφες (Queen, n = 24? Εργάτης, n = 24) και 52 3ης γενιάς νύμφες (Queen, n = 26? Εργάτης, n = 26) χρησιμοποιήθηκαν για ολική απομόνωση του RNA? για την αποικία Β, 46 1ου σταδίου προνύμφες (βασίλισσα, n = 23? εργαζόμενος, n = 23) και 47 3ης γενιάς νύμφες (βασίλισσα, n = 24? εργαζόμενος, n = 23) χρησιμοποιήθηκαν. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ανάστροφης μεταγραφάσης (Promega, Catalog # M1701) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Προσδιορισμός της ποσότητας (Ποσοτικοποίηση )των επιπέδων TOR, S6K και Dnmt3 mRNA σε βασίλισσα και των εργαζομένων προνύμφες TOR, τα επίπεδα S6K andDnmt3mRNA προσδιορίστηκαν με χρήση πραγματικού χρόνου PCR ακολουθώντας προηγούμενες περιγραφείσες μεθόδους (Amdam κ.ά., 2004? Patel et al, 2007) (Πίνακας 1). Εν συντομία, σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα συνολικό όγκο του διαλύματος αντίδρασης 20 μL, που περιείχε μείγμα SYBR 10 μί, cDNA 1 μL, Primer 1 (1 mmol / L) 1 μί, Primer 2 (1 mmol / L) 1 μL και ddH2O 7 μι. Τα κομμάτια στόχων ενισχύθηκαν κάτω από τις ακόλουθες συνθήκες θερμικού κύκλου: Ένας κύκλος αποδιάταξης για 3 λεπτά στους 95 ℃, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 10 s στους 94 ℃, 10 s στους 58 ℃ και 10 s στους 72 ℃. Το σήμα συλλέχθηκε σε 72 ℃ ανά κύκλο.
Πίνακας 1 Εκκινητές για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων του mRNA και τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA των γονιδίων TOR, S6K και Dnmt3
Εξέταση της μεθυλίωσης του DNA Σύνολο μετατροπή DNA Bisulfite διεξήχθη χρησιμοποιώντας το QIAGEN EpitectR Bisulfite Kit (Code Νο 59104), όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή.
Παλαιό DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας γονίδιο-ειδικούς εκκινητές (Πίνακας 1) σε όγκο 20 μί περιείχε 10 × PCR Ρυθμιστικού 2 μL, dNTP 1,6 μΙ, LA Taq DNA πολυμεράση 0,2 μί, Primer 1 (10 μmol / L) 0,4 μί, Primer 2 (10 μmol / L) 0,4 μί, DNA εκμαγείου 1 μL, ddH2O 14,4 μL.
PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε με ένα αρχικό κύκλο μετουσίωση για 5 λεπτά στους 95 ℃, που ακολουθείται από 40 κύκλους του 1 min στους 95 ℃, 1 λεπτό στους 50 ℃ και 1 λεπτό στους 72 ℃. Χρησιμοποιήσαμε 0,5 μι του πρώτου προϊόντος PCR ως εκμαγείο για το δεύτερο γύρο της ενίσχυσης PCR υπό τις ίδιες συνθήκες θερμικού κύκλου.
Τα καθαρισμένα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν σε PGM-Τ φορέα (TIANGEN, VT202-02). Ανασυνδυασμένοι κλώνοι επιλέχθηκαν με άπλωμα των μετασχηματισμένων κυττάρων ϋΗ5α (TIANGEN, CB101) επί πλακών Amp + LB.
Δεκατέσσερις έως 20 κλώνοι επιλέχθηκαν για κάθε τεμάχιο για αλληλούχιση.
Ανάλυση δεδομένων
Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με Prism 4.0. t-testwas έγιναν προνύμφες Βασιλισσών και εργατριών.
Μια τιμή Ρ <0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Τα επίπεδα mRNA για TOR είναι διαφορετικά μεταξύ προνυμφών βασίλισσας και εργάτριας 3ου σταδίου, αλλά ίδια στο 1ο στάδιο προνυμφών.
Χρησιμοποιώντας το 1ο και 3ο σταδίου προνυμφών για βασίλισσες και εργάτριες που εκτρέφονται σε αποικία, μετρήσαμε τα σχετικά επίπεδα mRNA των γονιδίων TOR, S6K και Dnmt3.
Εμείς δεν βρήκαμε καμία διαφορά μεταξύ των προνυμφών βασίλισσας και των εργατριών 1ου σταδίου (σχήμα 1).
Ωστόσο, τα επίπεδα πρωτεϊνών TOR mRNA σε 3ο στάδιο προνυμφών βασίλισσας ήταν υψηλότερα από ό, τι σε προνύμφες των εργατριών, ενώ δεν υπήρχαν διαφορές ως προς τα επίπεδα S6K και Dnmt3 mRNA μεταξύ 3ου σταδίου προνυμφών βασίλισσας και των προνυμφών της εργάτριας (σχήμα 2).
Για την επιβεβαίωση αποτελεσμάτων μας, εξετάσαμε και δεύτερο μελίσσι (αποικία Β) με παρόμοια αποτελέσματα (σχήμα 1, σχήμα 2).
Σχήμα 1 Σύγκριση της σχετικής ποσότητας (RQ) του γονιδίου TOR (Α), γονίδιο S6K (Β) και Dnmt3 γονίδιο (Γ) τα επίπεδα mRNA στο 1ο στάδιο προνυμφών.
Σχήμα 2 Σύγκριση της σχετικής ποσότητας (RQ) του γονιδίου TOR (Α), γονίδιο S6K (Β) και Dnmt3 γονίδιο (Γ) τα επίπεδα mRNA στο 3ο στάδιο προνυμφών.
Στο 3ο στάδιο προνυμφών, το επίπεδο μεθυλίωσης του DNA είναι χαμηλότερο σε προνύμφες βασίλισσας σε σχέση με τις προνύμφες της εργάτριας, αλλά οι διαφορές δεν είναι σημαντικές.
Για να διαπιστωθεί αν η έκφραση του mRNA του TOR, S6K και Dnmt3 ρυθμίζονται από μεθυλίωση του DNA εξετάσαμε τα επίπεδα μεθυλίωσης για αυτά τα γονίδια στην 3ο στάδιο προνυμφών (1ου σταδίου προνύμφες δεν αναλύθηκαν, καθώς δεν βλέπω καμία αλλαγή στην έκφραση του mRNA για αυτά τα τρία γονίδια) .
Αυτό διαπιστώθηκε σε προηγούμενες μελέτες με CpG μεθυλίωση σε Apis μέλισσες στα περισσότερα εξεταζόμενα κελιά (Kucharski et al, 2008? Wang et al, 2006).
Ως εκ τούτου, για το γονίδιο TOR, επιλέξαμε το συγκεκριμένο κελί 4, το οποίο περιέχει 18 δινουκλεοτίδια για εξέταση.
Το συνολικό ποσό των TOR μεθυλίωσης είναι 14,3% σε προνύμφες βασίλισσας έναντι 17,5% στις προνύμφες των εργατριών (σχήμα 3A).
Για το γονίδιο S6K, εμείς διαλέξαμε το κελί 10, το οποίο περιέχει 7 δινουκλεοτίδια CpG, και βρήκαμε ότι το συνολικό ποσό της S6K μεθυλίωσης σε προνύμφες βασίλισσα (17,5%) ήταν χαμηλότερη από εκείνη των προνυμφών των εργατριών (19,8%)( σχήμα 3B) .
Για το γονίδιο Dnmt3, παρατηρήσαμε επίσης ένα χαμηλότερο επίπεδο μεθυλίωσης σε προνύμφες βασίλισσας (5%) σε σχέση με τις προνύμφες των εργατριών (6,2%), όταν επικεντρώνεται στο κελί 9 του γονιδίου αυτού, που φιλοξενεί 13 CpG δινουκλεοτίδια (σχήμα 3c).
Συνολικά, οι ποσότητες CpG μεθυλίωσης και των τριών γονιδίων σε προνύμφες βασίλισσα ήταν περίπου 20% χαμηλότερη σε σύγκριση με τις προνύμφες των εργαζομένων (σχήμα 3).
Ωστόσο, αυτά τα δεδομένα δεν ήταν στατιστικά διαφορετικά, πιθανώς λόγω του περιορισμένου αριθμού των ατόμων που αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη.
Σχήμα 3 Σύγκριση του επιπέδου μεθυλίωσης κυτοσινών σε CpG δινουκλεοτίδια στο κελί 4 του γονιδίου TOR (Α), το κελί 10 του γονιδίου S6K (Β) και το κελί 9 του γονιδίου Dnmt3 (C)
ΣΥΖΗΤΗΣΗ
Η συμμετοχή της διατροφής στη διφαινική ανάπτυξη στις θηλυκές μέλισσες έχει αναγνωριστεί από καιρό (Maeterlinck 1901),αλλά η ανεπαρκής γνώση έχει συσσωρευτεί σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν τις διαφορές στην ανάπτυξη. Πρόσφατα, οι μελέτες έχουν αποδείξει ότι δύο πρωτεΐνες, TOR και DNA methyltransferase Dnmt3, παίζουν κεντρικούς ρόλους στη διαφοροποίηση καστών ( των κοινωνικών τάξεων ) Apis mellifera (Kucharski et al 2008 Patel et al, 2007) η TOR είναι γνωστή ως μια σερίνη/θρεονίνη κινάση που ελέγχει την αύξηση/ανάπτυξη σε σχέση με τη διατροφή/ανατροφή. Patel et al (2007) διαπίστωσαν ότι η υψηλή έκφραση του γονιδίου TOR είναι ουσιαστική για μια προνύμφη να γίνει βασίλισσα Kucharski et al (2008) και έδειξαν ότι η μείωση του γονιδίου Dnmt3 στις προνύμφες που προορίζονται για εργάτριες οδηγεί στην ανάπτυξη βασίλισσας. Μερικές αναλύσεις αποδεικνύουν ότι το methyltransferase DNA μπορεί να αδρανοποιήσει ή να καταστείλει ένα γονίδιο από τη μεθυλίωση DNA (Τζόουνς & Gonzalgo, 1997 Razin, 1998 Weiss & & Cedar, 1997; Wolffe et al, 1999; Yamada et al, 2008) . Σύμφωνα με την έκθεση από Patel et al (2007) τα mRNA επίπεδα έκφρασης του TOR που μετρήθηκαν εδώ ήταν πιο υψηλά στις τρίτου σταδίου προνύμφες βασίλισσας από τις προνύμφες εργαζομένων (σχήμα 2). Εντούτοις, δεν υπήρξε καμία διαφορά για τα επίπεδα TOR και mRNA στις πρώτου βαθμού προνύμφες βασίλισσας και εργαζομένων (σχήμα 1). Αυτό τοαποτέλεσμα προτείνει ότι το TOR διαδραματίζει το ρυθμιστικό ρόλο του σε μια κρίσιμη περίοδο ανάπτυξη που παρέχει τα νέα μοριακά στοιχεία για να επιβεβαιωθεί η προηγούμενη διαπίστωση ότι το τρίτο στάδιο είναι ένα κρίσιμο σημείο για το τμήμα καστών μελισσών (για τη κοινωνική κατάταξη ) των μελισσών (de Wilde& Beetsma, 1982 Handre & Lees, 1985). Καμία σημαντική διαφορά στα επίπεδα μεθυλίωσης DNA του γονιδίου TOR δεν βρέθηκε μεταξύ των προνυμφών βασίλισσας και εργαζομένων, αν και οι προνύμφες εργαζομένων είχαν ένα σχετικά χαμηλότερο επίπεδο μεθυλίωσης DNA (σχήμα 3). Επιπλέον, δεν υπήρξε καμία διαφορά mRNA στην έκφραση Dnmt3 και στις δύο προνύμφες (σχήμα2) και αυτή η παρατήρηση υπονοεί ότι την έκφραση TOR mRNA δεν μπορεί από Dnmt3 να μεσολαβήσει μέσω της μεθυλίωσης DNA.
S6K είναι μια άλλη κινάση που ελέγχει την αύξηση των κυττάρων. το γεγονός ότι σταματάει η ανάπτυξη του S6K γονιδίου στις μύγες και τα ποντίκια φρούτων οδηγεί στην ακραία αναπτυξιακή καθυστέρηση και τους μικρότερους οργανισμούς (Montagne & Steward, 1999; Shima et al, 1998) που μας οδηγεί στην υπόθεση ότι η S6K μπορεί να βοηθήσει στη διαφοροποίηση καστών στις μέλισσες. Δείξαμε ότι η έκφραση mRNA του S6K γονιδίου στις προνύμφες βασίλισσας ήταν ελαφρώς υψηλότερη από τις προνύμφες εργαζομενες του τρίτου σταδίου (ένα κρίσιμο αναπτυξιακό στάδιο για τον προσδιορισμό καστών) αν και αυτό δεν έφθασε στη στατιστική σημασία (σχήμα 2). Σύμφωνα με mRNA τα σχέδια έκφρασης, βρήκαμε ένα ελαφρώς χαμηλότερο επίπεδο μεθυλίωσης DNA του S6K γονιδίου στις προνύμφες βασίλισσας από ό τι στις προνύμφες εργατριών.
Σε συνδυασμό με την έκθεση από Kamakura (2011) η καταστολή S6K μεRNAi εμπόδισε την ανάπτυξη στο ενήλικο μέγεθος των προνυμφών που ταΐστηκαν με βασιλικό πολτό, μας βάζει στην υποψία ότι η S6K μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο στη διαφοροποίηση καστών μελισσών Η περαιτέρω μελέτη σχετικά με το ρόλο S6K που υπάρχουν δυο καθοριστικά φαινότυπα στον πληθυσμό των καστών μελισσών είναι σαφώς ουσιαστική. Στο πείραμα μεθυλίωσης DNA επιλέξαμε ένα κελί ως στόχο για να υπολογίσουμε τη γενική ποσότητα μεθυλίωσης κάθε γονιδίου.
Αν και τα μεθυλιωμένα κελιά (CpG) μπορούν να είναι ετερογενή σε όλο το γονίδιο, τουλάχιστον 7 κελιά (CpGs) από το κομμάτι κηρήθρας που κόπηκε είναι ικανές να αντιπροσωπεύσουν το γενικό επίπεδο μεθυλίωσης σε γενικές γραμμές, όπως αποδεικνύεται στις προηγούμενες μελέτες (Kucharski et al, 2008; Wang et al, 2006).
Παρά το γεγονός ότι μερικά ειδικά γονίδια έχουν τα εναλλακτικά κελιά , η μεθυλίωση DNA ή άλλες επιγενετικές τροποποιήσεις συσχετίζονται με την εναλλακτική μορφή σύνδεσης των κελιών (Chittka & Chittka, 2010; Luco et al, 2011; Lyko et al, 2010) και η μεθυλίωση προωθούν την έκφραση μερικών νευρογενών γονιδίων με λειτουργικό σκοπό να αντιμετωπίσουν προκλητικά την καταστολή Polycomb (Wu et al, 2010). Η μείωση της ποσότητας μεθυλίωσης DNA ενός γονιδίου μπορεί να διευκολύνει την έκφρασή της για τη συντριπτική πλειοψηφία των γονιδίων. Εντούτοις ,είναι δύσκολο να καθοριστεί η άμεση σχέση μεταξύ της μεθυλίωσης DNA και mRNA της έκφρασης ορισμένων γονιδίων επειδή οι διαδεδομένες διαφορές έκφρασης γονιδίων μπορούν να προκληθούν από τις αλλαγές σε έναν μικρό αριθμό αντίθετου ρεύματος ρυθμιστών (Carone et al, 2010). Οι διαφορές στην πρωτεϊνική έκφραση μεταξύ των τριών (3) ημερών προνυμφών εργατριών και βασίλισσας είναι γνωστές, δείχνοντας ότι η μοίρα των προνυμφών βασίλισσας και εργατριών έχει καθοριστεί ( αποφασιστεί ) ήδη πριν από το τρίτο στάδιο (Li et al, 2010).
Συμπερασματικά, ερευνήσαμε την έκφραση του mRNA και τη μεθυλίωση DNA του Dnmt3, TOR και S6K στις προνύμφες που προορίζονται για βασίλισσες και εργάτριες προκειμένου να καθοριστεί εάν mRNA έκφραση του TOR και S6K ελέγχεται απόDnmt3 μέσω της μεθυλίωσης DNA. Τα αποτελέσματά μας δεν παρουσίασαν καμία διαφορά στην έκφραση γονιδίων (εκτός από το TOR) μεταξύ των τρίτου σταδίου βασίλισσας και εργαζομένων προνυμφών. Επιπλέον, τα επίπεδα μεθυλίωσης DNA αυτών των τριών γονιδίων και στις δύο προνύμφες δεν διέφεραν, αν και οι προνύμφες βασίλισσας είχαν ένα σχετικά χαμηλότερο επίπεδο μεθυλίωσης. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι στο mRNA η έκφραση του TOR δεν ρυθμίζεται από Dnmt3 εάν τώρα η S6K ρυθμίζεται από το Dnmt3, αυτό δεν έχει αποσαφηνιστεί .
Κατά συνέπεια, η σημασία της μεθυλίωσης θέσεως (CpG) στα κελιά στις μέλισσες πρέπει να επαναξιολογηθεί.
πηγή: Εθνική Βιβλιοθήκη Ιατρικής των ΗΠΑ
Δεν υπάρχουν σχόλια:
Δημοσίευση σχολίου